《生命科學(xué)實驗指南系列 RNA納米技術(shù)與治療：方法與方案》主要內(nèi)容是對近年來與RNA納米技術(shù)以及它在納米生物技術(shù)和納米醫(yī)藥的應(yīng)用直接相關(guān)的技術(shù)和實驗室方案的匯編。涉及的主題包括分析RNA結(jié)構(gòu)和性能的各種生物化學(xué)、生物物理和生物信息學(xué)方法；分析RNA結(jié)構(gòu)的多級裝配過程的方法：通過超速離心和高效液相色譜法（HPLC）純化多功能RNA納米顆粒；體內(nèi)RNA納米構(gòu)建物的實時檢測；成像、目標(biāo)定位和治療效應(yīng)模塊分子結(jié)合到RNA支架上；RNA-蛋白質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的設(shè)計和特性描述等。
RNA納米技術(shù)是一個涉及材料工程和合成結(jié)構(gòu)生物學(xué)的新領(lǐng)域，是一種新興的生物化學(xué)和納米材料的交叉學(xué)科。
《生命科學(xué)實驗指南系列 RNA納米技術(shù)與治療：方法與方案》各章節(jié)涵蓋的研究方法可供RNA/DNA相關(guān)科學(xué)研究的研究生和博士后研究人員逐步地進行理解和操作。
《生命科學(xué)實驗指南系列 RNA納米技術(shù)與治療：方法與方案》亦可作為關(guān)注RNA納米技術(shù)的從事物理、工程和生命科學(xué)研究的人員的學(xué)習(xí)參考材料。
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此書是大家所熟知的“Methods in Molecular Biology”實驗室方案系列叢書的新成員。盡管已出版了一本特刊“Methods”（Volume 54；Issue 2，Page 201-294，2011，Elsevier）和一部著作（RNA Nanotechnology and Therapeutics，2013，CRC出版社），這本書仍是對與RNA納米技術(shù)及其在納米生物技術(shù)和納米醫(yī)藥中的應(yīng)用直接相關(guān)的技術(shù)和實驗室方案的首次匯編。RNA納米技術(shù)（Guo P.Nature Nanotechnology，2010，5：833-842）利用在多層次結(jié)構(gòu)水平的RNA折疊和裝配的模塊化及設(shè)計性來合理設(shè)計并功能化具有不同應(yīng)用的RNA納米顆粒。雖然在15年前自下而上組裝RNA納米技術(shù)的概念就被證明過（Guoeta1.Molecular Cell，1998.2：149），但在這個領(lǐng)域中有意義的進步也只是近5年的事情。為了推進該領(lǐng)域研究邁向新的高度，我們及時編輯出版了這本方法書，供從事物理、工程和生命科學(xué)的研究人員參考。
本書涵蓋的研究方法很廣泛，便于經(jīng)歷過不同科學(xué)訓(xùn)練的研究生和博士后人員分步進行理解與操作。全書內(nèi)容包括：分析核糖核酸（RNA）結(jié)構(gòu)和性能的各種生物化學(xué)、生物物理和生物信息學(xué)方法（第2～4章）；分析RNA結(jié)構(gòu)的多級裝配過程的方法（第4、7和10章）；通過超速離心和高效液相色譜法（HPLC）（第5和6章）純化多功能RNA納米顆粒；體內(nèi)RNA納米構(gòu)建物的實時檢測（第7、9、10章）；成像、目標(biāo)定位和治療模塊結(jié)合到RNA支架上（第8～13章）；RNA-蛋白質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的設(shè)計和特性描述（第14～16章）。這項任務(wù)的完成得益于在這一領(lǐng)域領(lǐng)先的有關(guān)專家，花費大量時間編寫了各章節(jié)，在此，我們向他們表示衷心感謝。同時，由衷感謝Humana出版社/Springer的編輯和制作人員，尤其要感謝的是Methods in Molecular Biology系列叢書的總編輯John Walker先生，是他讓我們下決心著手實施這個計劃。我們很高興這本內(nèi)容豐富的書得以出版，希望各領(lǐng)域的研究者均能從中有所收益。
目錄
前言
第1章RNA納米技術(shù)方法綜述——RNA納米顆粒的合成、純化及特性 1
1RNA納米技術(shù)的定義 1
2構(gòu)建多功能RNA納米顆粒 2
2.1納米顆粒的RNA支架組裝 4
2.2合并功能模塊為RNA納米顆粒 7
3多功能RNA納米顆粒的純化和特征 11
3.1凝膠移位分析 11
3.2超速離心法 11
3.3高效液相色譜法 12
3.4RNA納米顆粒的結(jié)構(gòu)特征 12
3.5RNA納米顆粒的功能試驗 13
4展望 13
5結(jié)論 14
致謝 14
參考文獻 14
第2章調(diào)查細菌小調(diào)控RNA自我組裝的多種方法 19
1引言 19
2材料 23
2.1試劑 23
2.2緩沖液和溶液 23
3方法 24
3.1用于聚合作用研究的小非編碼RNA（sRNA）的體外轉(zhuǎn)錄 24
3.2電泳分析sRNA的自組裝 25
3.3二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和sRNA自組裝最小序列的特征 25
3.4熱變性分析 26
3.5利用近紅外光譜分析堿基配對 28
3.6sRNA組裝的分子成像 30
3.7粗提物中sRNA聚合物的檢測 33
3.8非編碼sRNA的RT-PCR定量分析 34
3.9結(jié)論 35
4注釋 36
致謝 36
參考文獻 36
第3章使用AFM測量包含核糖核苷酸的DNA分子的彈性 40
1引言 40
2材料 42
2.1寡核苷酸 42
2.2寡核苷酸上硫醇基的去保護 43
2.3原子力顯微鏡底襯的制備 43
2.4制備鍍金的羧基修飾的氮化硅懸臂 43
2.5在金表面固定DNA底襯 43
2.6原子力顯微鏡液體電池 44
2.7原子力顯微鏡和配件 44
3方法 44
3.1制備含核糖核苷一磷酸的DNA寡核苷酸 44
3.2制備雙鏈嵌入式-核糖核苷一磷酸DNA基質(zhì) 45
3.3制備鍍金羧基修飾氮化硅懸臂及含核糖核苷一磷酸的DNA基質(zhì)的固定化 45
3.4用于測量力的原子力顯微鏡的校準(zhǔn) 46
3.5原子力顯微鏡液體電池的清潔 47
3.6利用原子力顯微鏡力光譜測量雙鏈含核糖核苷一磷酸的DNA的彈性 47
3.7數(shù)據(jù)分析 48
4注釋 50
致謝 51
參考文獻 51
第4章RNA納米技術(shù)之銀納米簇：RNA納米顆粒組裝的觀察以及跟蹤的步驟 55
1引言 55
2材料 56
2.1轉(zhuǎn)錄和RNA納米顆粒組裝成分 56
2.2Ag:RNA成分 57
3方法 57
3.1RNA合成 57
3.2RNA納米立方體的組裝 57
3.3RNA組裝的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗 58
3.4合成Ag:RNA 58
3.5Ag:RNA光學(xué)測量 58
4注釋 59
致謝 60
參考文獻 61
第5章利用制備性超速離心大規(guī)模純化RNA納米顆粒 63
1引言 63
2材料 67
2.1梯度準(zhǔn)備 67
2.2超速離心 68
2.3分餾和樣品分析 68
3方法 69
3.1CsCl平衡密度法純化RNA 69
3.2速率區(qū)帶蔗糖梯度法分離納米顆粒 70
3.3分餾和樣品分析/回收（CsCl和蔗糖的相同） 72
3.4預(yù)期結(jié)果 73
4注釋 73
致謝 75
參考文獻 75
第6章HPLC純化長達59個核苷酸具有單核苷酸分辨率的RNA適配體 78
1引言 78
2材料 80
2.1RNA樣品 80
2.2HPLC儀器 81
2.3試劑和緩沖液 81
3方法 81
3.1配制緩沖液 81
3.2初始化和平衡柱子 81
3.3上樣 82
3.4再平衡柱子 83
3.5樣品處理 83
4注釋 83
參考文獻 87
第7章在原核和真核細胞中利用具有熱力學(xué)穩(wěn)定基序和熒光模塊的RNA納米顆粒實時檢測RNA的折疊和翻轉(zhuǎn) 89
1引言 89
2材料 91
2.1體外轉(zhuǎn)錄和純化RNA 91
2.2在E.coli中表達RNA 92
2.3體外和體內(nèi)MG/DFHBI結(jié)合分析 93
2.4動物及人類細胞中RNA表達、折疊和降解的熒光成像 93
3方法 94
3.1融合RNA納米顆粒的設(shè)計 94
3.2通過T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄制備RNA納米顆粒并用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化RNA 95
3.3利用細菌表達、裝配和純化RNA納米顆粒 95
3.4通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳體外評估RNA折疊 96
3.5通過MG分析，體外評估RNA的折疊 98
3.6通過DHBFI結(jié)合分析，體外評估RNA折疊 98
3.7體外監(jiān)測RNA降解 98
3.8細菌體內(nèi)RNA折疊的評估 98
3.9真核細胞中RNA折疊的評估 99
3.10在動物和人類細胞中實時檢測RNA納米顆粒半衰期 100
4注釋 101
致謝 103
參考文獻 103
第8章小RNA3端氧化的熒光標(biāo)記 105
1引言 105
2材料 106
2.1體外轉(zhuǎn)錄組分 106
2.2標(biāo)記組分 107
2.3凝膠阻滯成分 107
3方法 107
3.1體外轉(zhuǎn)錄 107
3.2RNA標(biāo)記 108
3.3凝膠阻滯分析 109
4注釋 109
致謝 110
參考文獻 111
第9章RNA納米顆粒對轉(zhuǎn)移性腫瘤靶向定位及給藥的方法和分析 112
1引言 112
2材料 113
2.1試劑 114
2.2設(shè)備 115
2.3試劑配制（見注釋1） 116
3方法 117
3.1三叉接口（3WJ）自我裝配 117
3.2通過激光共聚焦顯微鏡試驗pRNA-3WJ納米顆粒的細胞結(jié)合和內(nèi)化 118
3.3通過流式細胞儀（FACS）實驗檢測pRNA-3WJ納米顆粒的細胞結(jié)合（可選） 118
3.4為了產(chǎn)生小鼠皮下移植瘤，皮下注射腫瘤細胞（圖9-3） 119
3.5為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)移瘤小鼠模型，在脾內(nèi)注射腫瘤細胞 119
3.6靶腫瘤細胞中熒光RNA納米顆粒的IVIS光譜在體成像（見注釋13） 120
3.7靶標(biāo)腫瘤組織中RNA熒光納米顆粒的微觀成像 122
3.8用流式細胞儀分析新鮮組織（可選） 122
4注釋 123
致謝 124
參考文獻 124
第10章RNA納米顆粒在腦瘤中靶向給藥的功能性試驗 127
1引言 127
2材料 128
2.1材料 128
2.2設(shè)備 129
2.3試劑配制 130
3方法 131
3.1體內(nèi)合成RNA以及構(gòu)建RNA納米顆粒 131
3.2用原子力顯微鏡成像顯示RNA納米顆粒的結(jié)構(gòu) 131
3.3流式細胞儀分析體外檢測葉酸介導(dǎo)的人腦瘤細胞定位（圖10-2） 133
3.4熒光共聚焦顯微鏡體外檢測葉酸介導(dǎo)的人癌細胞定位（圖10-3） 134
3.5向小鼠模型系統(tǒng)中移植腦瘤（圖10-4） 135
3.6利用核磁共振成像（MRI）對小鼠植入腦瘤的定位并測量大�。▓D10-4） 135
3.7患有腦瘤小鼠的間接體內(nèi)熒光成像（圖10-5） 136
3.8siRNA給藥后體內(nèi)生物熒光全身成像檢測腦瘤（圖10-6） 137
4注釋 138
致謝 140
參考文獻 140
第11章適配體介導(dǎo)的納米顆粒相互作用：從寡核苷酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體到SELEX篩選 142
1引言 142
2材料 144
2.1流感病毒基質(zhì)蛋白-1 144
2.2寡聚核苷酸合成和純化 144
2.3自動化的SELEX 145
2.4RNA候選的自動化合成 145
2.5Alpha Screen試驗 145
3方法 146
3.1SELEX 146
3.2C6（36）適配體的特性：AlphaScreen?的M1復(fù)合體 146
3.3C1（36）-M1分析 149
3.4C1（36）-M1-C6（36）夾心試驗 149
3.5HAP Iscreen 151
4注釋 154
致謝 154
參考文獻 154
第12章通過黏性橋組合特異性的適配體siRNA納米顆粒的方法內(nèi)化B細胞淋巴瘤 157
1引言 157
2材料 159
2.1細胞系 159
2.2通過體外轉(zhuǎn)錄合成BAFF-RR-1和HIV-1gp120A-1對照適配體 160
2.3適配體-黏性siRNA納米顆粒的結(jié)構(gòu) 161
2.4通過凝膠遷移試驗確定分離常數(shù) 161
2.5通過激光共聚焦顯微鏡分析細胞內(nèi)化 162
2.6RNA抽提 162
2.7利用RT-PCR進行基因沉默 162
2.8通過MTS試驗和流式細胞術(shù)分析細胞增殖及凋亡 163
2.9siRNA的電轉(zhuǎn)化 163
3方法 163
3.1通過體外轉(zhuǎn)錄的BAFF-RR-1和HIV-1gp120A-1控制適配體的合成 164
3.2BAFF-RR-1適配體-黏性-STAT3siRNA納米顆粒的產(chǎn)生 164
3.3利用凝膠遷移試驗測定分離常數(shù) 164
3.4利用激光共聚焦顯微鏡分析細胞內(nèi)化 166
3.5通過定量RT-PCR分析STAT3siRNA功能 167
3.6通過MTS試驗分析細胞增殖 168
3.7利用流式細胞法分析細胞凋亡 168
4注釋 169
致謝 170
參考文獻 170
第13章一種用于在人黑色素瘤細胞中剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸的功能運輸?shù)母咄亢Y選方法 173
1引言 173
2材料 175
2.1A375pLuc細胞培養(yǎng)和SSO轉(zhuǎn)染 175
2.2熒光素酶檢測 175
2.3RT-PCR檢測 175
3方法 176
3.1A375pLuc細胞培養(yǎng)和SSO轉(zhuǎn)染步驟（見注釋9） 176
3.2熒光素酶檢測 176
3.3RNA提取和RT-PCR（見注釋10） 177
4注釋 179
參考文獻 180
第14章RNA-蛋白納米結(jié)構(gòu)的設(shè)計、組裝和評估 182
1引言 182
2材料 184
2.1設(shè)計 184
2.2合成 185
2.3電泳遷移率試驗 186
2.4大氣中原子力顯微鏡 186
3方法 187
3.1設(shè)計 187
3.2合成 188
3.3電泳遷移率試驗（EMSA） 190
3.4大氣中原子力顯微鏡（AFM） 191
4注釋 192
致謝 194
參考文獻 194
第15章利用CLIP-Seq技術(shù)在病毒中定位RNA和蛋白質(zhì)的相互作用 196
1引言 196
2材料 199
2.1交聯(lián)和免疫沉淀組分 199
2.2RNA片段化和提取試劑 200
2.3cDNA文庫構(gòu)建及序列組成 200
3方法 200
3.1紫外交聯(lián)和RNA片段化 200
3.2免疫沉淀反應(yīng)和RNA提取 201
3.3cDNA文庫構(gòu)建 203
3.4數(shù)據(jù)分析 204
4注釋 205
致謝 205
參考文獻 206
第16章用RCAP、RNA交聯(lián)和肽段指紋識別技術(shù)定位蛋白質(zhì)RNA相互作用 208
1引言 208
1.1RCAP 209
1.2甲醛交聯(lián) 209
1.3親和捕獲RNA 210
1.4質(zhì)譜分析 211
1.5數(shù)據(jù)分析 211
1.6RCAP數(shù)據(jù)的獨立確定 212
2材料 213
2.1RCAP試驗：交聯(lián)和胰蛋白酶消化試劑 213
2.2RCAP試驗：RNA沉淀和重懸浮 213
2.3樣品清除 214
3方法 214
3.1RCAP試驗：RNA-多肽復(fù)共軛對配合物的制備 214
3.2RCAP試驗：RNA-肽段復(fù)共軛對配合物的沉淀和再懸浮 214
3.3樣品處理和質(zhì)譜分析 215
4注釋 215
致謝 216
參考文獻 216
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